J’ai pensé récemment à explorer l’idée de fabriquer un dispositif de dépistage PCR, et voir à quel point cet appareil peut être confectionné par un amateur et un (presque) inculte en sciences naturelles et biologie. J’avais aussi l’objectif de comprendre pourquoi déployer des tests PCR à grande échelle était difficile et ce à partir du design technique de la solution. Dans une série d’articles je vais essayer de compiler les informations trouvées sur internet et peut être même, qui sait, arriver à un prototype ou vous aider à le faire. Mais tout d’abord, dans ce premier article, je vais vous résumer mes recherches sur l’histoire du test PCR.
Comme la pénicilline ou le four à micro-ondes, la PCR a été découverte par hasard. Grâce au travail de nombreux scientifiques, et les principaux ingrédients de la PCR ont été décrits en 1980.
Le père de la PCR
Kary B. Mullis, Qui a travaillé pour Cetus Corporation à perfectionner la synthèse d’oligonucléotides a reçu le prix Nobel de chimie en 1993 (avec Michael Smith) pour ses travaux sur la PCR et est accrédité pour son invention. Comme de nombreuses grandes inventions et découvertes qui s’avèrent par la suite extrêmement importantes, il a fallu du temps à la communauté scientifique pour s’intéresser à la PCR.
Lorsque Mullis a présenté une recette de PCR lors d’une conférence, personne ne pouvait concevoir le produit final. À son point le plus bas, la carrière de Mullis a presque déraillé car sa défense de son idée a conduit à une altercation lors de la conférence et il a été démis de ses fonctions de chef du laboratoire de synthèse des oligonucléotides.
La science rejettera son article sur la PCR uniquement pour le nommer et la Taq polymérase «Molécule de l’année» trois ans plus tard.
Grâce à une collaboration avec le laboratoire Erlich, le projet de PCR est de retour et au cours des prochaines années, il a été perfectionné et diverses applications développées, y compris les empreintes génétiques d’ADN (1986), les systèmes d’amplification génique (1988), la PCR en temps réel avec bromure d’éthidium (1992) et séquençage du génome (2001).
Conception du PCR
Mullis s’intéressait à la chimie depuis son enfance, quand ses amis et lui passaient des heures à faire exploser des choses. Après avoir assisté à un séminaire sur la synthèse d’ADN et le clonage de gènes, il a réalisé que la chimie pouvait être utilisée pour fabriquer de l’ADN et son enthousiasme l’a conduit à postuler avec succès pour un poste chez Cetus.
Pas loin des bureaux de Mullis, Il y avait aussi le laboratoire Henry Erlich qui essayait de développer des méthodes pour détecter des mutations ponctuelles dans le matériel génétique. Le laboratoire d’Erlich avait conçu une technique connue sous le nom de restriction des oligomères (oligomer restriction) et qui allait devenir l’idée fondatrice menant à la PCR.
Oligomer Restriction (abbreviated OR) is a procedure to detect an altered DNA sequence in a genome. A labeled oligonucleotide probe is hybridized to a target DNA, and then treated with a restriction enzyme. If the probe exactly matches the target, the restriction enzyme will cleave the probe, changing its size. If, however, the target DNA does not exactly match the probe, the restriction enzyme will have no effect on the length of the probe.
Cette technique posait déjà beaucoup de problèmes à l’époque, et est presque abandonnée aujourd’hui. Cependant, en réfléchissant aux solutions pour cette technique, Mullis a conçu le concept de la PCR en 1983.
Restriction des oligomères
Mullis a finalement trouvé une idée: au lieu d’un seul cycle de réplication, plusieurs cycles pourraient être utilisés en présence de grandes quantités des quatre nucléosides triphosphates et en utilisant une deuxième sonde oligonucléotidique pour le brin complémentaire de la séquence cible.
Ceci éliminerait le besoin d’enzymes de restriction et, ainsi, n’importe quelle séquence pourrait être utilisée une fois qu’une amorce spécifique aurait été faite pour elle.
Étant donné qu’à chaque cycle de réplication successif, le nombre de produits de séquence cible augmenterait pour finalement dépasser de loin tout séquençage contaminant, un échantillon de départ plus pur avec la séquence cible en abondance ne serait pas nécessaire.
Comme les séquences cibles pourraient être faites pour avoir une longueur spécifique, elles pourraient être détectées sur un gel sous forme de fragments de restriction et ainsi une liaison non spécifique ou une liaison à une séquence non intéressante n’interférerait pas avec les résultats.
Premières analyses PCR
Lorsque Mullis a essayé la PCR pour la première fois, il espérait qu’au lieu d’avoir besoin de cycles de température, les ingrédients prendraient soin d’eux-mêmes. Quelques expériences sans produit apparent lui ont montré ce qu’il redoutait le plus: que les températures devraient être réajustées pour faire passer la réaction de la température de l’ADN simple à double brin et, comme la polymérase utilisée à l’époque était thermiquement instable, une nouvelle enzyme serait doivent être ajoutés pour chacun des 30 tours nécessaires pour créer un produit presque pur.
Résolument, les températures devraient être contrôlées à la main. Cela signifiait chauffer la réaction jusqu’à 95 ° C, puis la laisser refroidir, ajouter de l’ADN polymérase et remonter la température 30 fois. Ainsi, cela prenait du temps, était épuisant et fastidieux. Tout le travail était à faire à la main.
Invention des thermocycleurs
En 1985 et 1987, la polymérase Taq thermostable et la première machine de PCR, le PCR-1000 Thermal Cycler, sont devenues disponibles sur le marché à la suite d’une joint-venture entre Cetus et Perkin-Elmer. Ceux-ci ont contribué à réduire le coût et les heures consacrées à l’exécution de cette technique et ont ouvert de nombreuses nouvelles applications pour son utilisation commerciale et pour la recherche.
Prochain article
Dans le prochain article, nous allons parler dans le détail de la technique du Real Time PCR (RT-PCR) qui se base sur des probes fluorescents pour detecter la présence de la séquence du Virus une fois répliqué par les différents cycle du PCR. Ceci nous donnera une idée sur les prérequis d’un tel test.
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