Dans cette partie de la série d’articles, nous allons traiter de la préparation de l’échantillon, mais aussi du déroulement du test et des différentes phases pour comprendre comment se compose un appareil de test PCR. Je tiens à remercier ma soeur Kenza qui m’a envoyé un super cours de biologie moléculaire qui m’a permis de comprendre le principe du test, loin d’être un expert, je vous prie d’être cléments et de corriger toute erreur.

Dans le dernier article, nous avons expliqué le processus de prélèvement. Il faut savoir qu’une fois le prélèvement fait, celui ci est transporté dans un médium de transport spécial qui préserve le prélèvement. En effet, il est important que ce prélèvement ne soit pas alteré jusqu’au laboratoire.

Le test PCR est donc utilisé pour pouvoir detecter la présence du virus Corona dans le prélèvement, ce qui revient à détecter la présence de son ARN (voir article précèdent). Le coronavirus contient une longue ARN à l’intérieur de sa structure en protéine qu’il va falloir isoler et détecter.

Il faut savoir que le test PCR sert principalement à multiplier (en millions) le nombre de brins d’adn complémentaire à l’arn (cADN) , ce brin d’adn est crée à travers une transcription inverse à partir de particules élémentaires qu’on va voir, et dans laquelle l’enzyme Polymérase joue un rôle capital, et de telle façon à avoir un maximum de ces bruns, on peut partir d’un simple brin pour finir avec des millions.

Dans la technique que nous allons détailler (RT-PCR Reverse Transciptase PCR) ceci se fait grâce à une variation des températures (comme expliqué dans l’article 1 sur l’histoire du PCR). La détection se fait ensuite grâce à un mécanisme optique que nous allons essayer de détailler dans le dernier paragraphe.

Isolation de l’arn (kits commerciaux) :

Pour isoler l’arn viral, les laboratoires procèdent par étapes.

La première étape consiste à mélanger une partie de l’échantillon avec le tampon de lyse. ce tampon intervient directement après le lavage des cellules (bactéries ou cellules humaines), et à pour rôle de les détruire. Suivant ce que l’on veut faire ensuite (extraction protéines, ADN et/ou ARN), la composition du tampon varie, mais il contiendra généralement un détergeant afin de briser la membrane cellulaire et d’autre composants, également variables, mais aussi des sels et un pouvoir tampon au pH désirée. Ensuite le mélange est mis dans une centrifugeuse, un appareil qui mélange les tubes d’essai dans un mouvement giratoire pour opérer l’effet souhaité.

Pour simplifier imaginer qu’il s’agira d’une moulinette pour briser la structure du virus tout en preservant l’arn qui nous interesse. Le résultat ressemblera à celà :

Ensuite il faudra purifier le résultat pour enlever les particules et ne laisser que l’arn. Ceci se fait grace à une colonne de biologie moléculaire (spin column). Une colonne est un élément souvent présent dans un kit de biologie moléculaire permettant de réaliser des extractions ou des purifications d’acides nucléiques par fixation sur un filtre.

Ensuite, le tout est mis dans la centrifugueuse.

La centrifugeuse force la solution de liaison à travers une membrane de gel de silice qui se trouve à l’intérieur de la colonne de centrifugation. Si le pH et la concentration en sel de la solution de liaison sont optimaux, l’acide nucléique se liera à la membrane de gel de silice lors du passage de la solution.

Imaginez donc que notre ARN va se coller sur les parrois de la colonne de la facon suivante, les débris, par l’effet de la gravité et d’un mélange “wash buffer” qui est rajouté, sont enlevé de l’échantillon. à la fin un “elution buffer” est rajouté dans une dernière centrifugation qui va détacher les brins arn de la parroi et les isoler dans notre échantillon.

Nous pouvons maintenant préparer le PCR :

Matière première du PCR

Ayant notre ARN isolé dans l’échantillon, nous faisons une deuxième préparation qui est sensé se composer des “matières premières” du PCR. Ces matières sont :

Transcriptase inverse : La transcriptase inverse ou rétrotranscriptase (en anglais reverse transcriptase ou encore RT) est une enzyme utilisée par les rétrovirus et les rétrotransposons qui transcrivent l’information génétique des virus ou rétrotransposons de l’ARN en ADN, qui peut s’intégrer dans le génome de l’hôte.

Nucléotides : ce sont des molécules organiques qui sont les éléments de base d’un acide nucléique tel que l’ADN ou l’ARN. Il est composé d’une base nucléique (ou base azotée), d’un ose à cinq atomes de carbone, dit pentose, dont l’association forme un nucléoside, et enfin de un à trois groupes phosphate.  Imaginez le comme étant l’alphabet ou les blocks qui servent à composer un ADN.

Amorces (deux amorces sont utilisées forward/reverse) : En biologie moléculaire, l’amorce est une courte séquence d’ARN ou d’ADN, complémentaire du début d’une matrice, servant de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette dernière matrice par une ADN polymérase.

Sondes TaqMan : Les sondes TaqMan (TaqMan Probes) sont des sondes d’hydrolyse conçues pour accroître la spécificité des techniques de PCR quantitative. La méthode a été pour la première fois décrite en 1991 par des chercheurs de l’entreprise Cetus Corporation1, avant que le développement de cette technologie ne soit poursuivi par Roche Molecular Diagnostics pour des applications de diagnostics cliniques et Applied Bioscience pour des applications en recherche.  cette sonde est essentielle pour le process de detection dont nous allons parler à la fin de notre article.

ADN Polymérase : Une ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l’ADN au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de l’ADN. Les ADN polymérases utilisent des désoxyribonucléosides triphosphate comme base pour la synthèse d’un brin d’ADN, en utilisant un autre brin d’ADN comme matrice.

Tous ces elements représentés dans l’image ci dessous représentent le Master Mix qui sera utilisé avec notre brin ARN pour initier le PCR :

Après avoir mixé (pulse mixating) ce mastermix avec l’arn extrait precedemment, ce nouvel echantillon est inseré dans le test PCR. Il faut savoir qu’un appareil PCR contient 96 slots de test, pour permettre plusieurs tests en parrallèles. Chaque échantillon utilise un slot.

Conclusions première partie :

Nous sommes à présent pret pour le test PCR, le prochain article décrira les étapes du test et les différents cycles ainsi que le processus de detection (optique) à travers la sonde TaqMan pour délibérer sur le résultat du test.