{"id":6844,"date":"2020-06-03T00:07:58","date_gmt":"2020-06-02T23:07:58","guid":{"rendered":"https:\/\/www.erroussafi.com\/?p=6844"},"modified":"2020-06-03T00:26:05","modified_gmt":"2020-06-02T23:26:05","slug":"covid-test-pcr-preparation-et-test-1-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/2020\/06\/03\/covid-test-pcr-preparation-et-test-1-2\/","title":{"rendered":"[COVID] \u2013 Test PCR \u2013 Pr\u00e9paration et test (1\/2)"},"content":{"rendered":"

Dans cette partie de la s\u00e9rie d’articles, nous allons traiter de la pr\u00e9paration de l’\u00e9chantillon, mais aussi du d\u00e9roulement du test et des diff\u00e9rentes phases pour comprendre comment se compose un appareil de test PCR. Je tiens \u00e0 remercier ma soeur Kenza qui m’a envoy\u00e9 un super cours de biologie mol\u00e9culaire qui m’a permis de comprendre le principe du test, loin d’\u00eatre un expert, je vous prie d’\u00eatre cl\u00e9ments et de corriger toute erreur.<\/p>\n

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Dans le dernier article, nous avons expliqu\u00e9 le processus de pr\u00e9l\u00e8vement. Il faut savoir qu’une fois le pr\u00e9l\u00e8vement fait, celui ci est transport\u00e9 dans un m\u00e9dium de transport sp\u00e9cial qui pr\u00e9serve le pr\u00e9l\u00e8vement. En effet, il est important que ce pr\u00e9l\u00e8vement ne soit pas alter\u00e9 jusqu’au laboratoire.<\/p>\n

Le test PCR est donc utilis\u00e9 pour pouvoir detecter la pr\u00e9sence du virus Corona dans le pr\u00e9l\u00e8vement, ce qui revient \u00e0 d\u00e9tecter la pr\u00e9sence de son ARN (voir article pr\u00e9c\u00e8dent). Le coronavirus contient une longue ARN \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur de sa structure en prot\u00e9ine qu’il va falloir isoler et d\u00e9tecter.<\/p>\n

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Il faut savoir que le test PCR sert principalement \u00e0 multiplier (en millions) le nombre de brins d’adn compl\u00e9mentaire \u00e0 l’arn (cADN) <\/strong>, ce brin d’adn est cr\u00e9e \u00e0 travers une transcription inverse \u00e0 partir de particules \u00e9l\u00e9mentaires qu’on va voir, et dans laquelle l’enzyme Polym\u00e9rase joue un r\u00f4le capital, et de telle fa\u00e7on \u00e0 avoir un maximum de ces bruns, on peut partir d’un simple brin pour finir avec des millions.<\/p>\n

Dans la technique que nous allons d\u00e9tailler (RT-PCR Reverse Transciptase PCR) ceci se fait gr\u00e2ce \u00e0 une variation des temp\u00e9ratures (comme expliqu\u00e9 dans l’article 1 sur l’histoire du PCR). La d\u00e9tection se fait ensuite gr\u00e2ce \u00e0 un m\u00e9canisme optique que nous allons essayer de d\u00e9tailler dans le dernier paragraphe.<\/p>\n

Isolation de l’arn (kits commerciaux) :<\/h1>\n

Pour isoler l’arn viral, les laboratoires proc\u00e8dent par \u00e9tapes.<\/p>\n

La premi\u00e8re \u00e9tape consiste \u00e0 m\u00e9langer une partie de l’\u00e9chantillon avec le tampon de lyse<\/strong>. ce tampon intervient directement apr\u00e8s le lavage des cellules (bact\u00e9ries ou cellules humaines), et \u00e0 pour r\u00f4le de les d\u00e9truire. Suivant ce que l’on veut faire ensuite (extraction prot\u00e9ines, ADN et\/ou ARN), la composition du tampon varie, mais il contiendra g\u00e9n\u00e9ralement un d\u00e9tergeant afin de briser la membrane cellulaire et d’autre composants, \u00e9galement variables, mais aussi des sels et un pouvoir tampon au pH d\u00e9sir\u00e9e. Ensuite le m\u00e9lange est mis dans une centrifugeuse<\/strong>, un appareil qui m\u00e9lange les tubes d’essai dans un mouvement giratoire pour op\u00e9rer l’effet souhait\u00e9.<\/p>\n

Pour simplifier imaginer qu’il s’agira d’une moulinette pour briser la structure du virus tout en preservant l’arn qui nous interesse. Le r\u00e9sultat ressemblera \u00e0 cel\u00e0 :<\/p>\n

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Ensuite il faudra purifier le r\u00e9sultat pour enlever les particules et ne laisser que l’arn. Ceci se fait grace \u00e0 une colonne<\/strong> de biologie mol\u00e9culaire (spin column<\/strong>). Une colonne est un \u00e9l\u00e9ment souvent pr\u00e9sent dans un kit de biologie mol\u00e9culaire permettant de r\u00e9aliser des extractions ou des purifications d’acides nucl\u00e9iques par fixation sur un filtre.<\/p>\n

Ensuite, le tout est mis dans la centrifugueuse.<\/p>\n

La centrifugeuse force la solution de liaison \u00e0 travers une membrane de gel de silice qui se trouve \u00e0 l’int\u00e9rieur de la colonne de centrifugation.<\/span> Si le pH et la concentration en sel de la solution de liaison sont optimaux, l’acide nucl\u00e9ique se liera \u00e0 la membrane de gel de silice lors du passage de la solution.<\/span><\/span><\/p>\n

Imaginez donc que notre ARN va se coller sur les parrois de la colonne de la facon suivante, les d\u00e9bris, par l’effet de la gravit\u00e9 et d’un m\u00e9lange “wash buffer” qui est rajout\u00e9, sont enlev\u00e9 de l’\u00e9chantillon. \u00e0 la fin un “elution buffer” est rajout\u00e9 dans une derni\u00e8re centrifugation qui va d\u00e9tacher les brins arn de la parroi et les isoler dans notre \u00e9chantillon.<\/p>\n

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Nous pouvons maintenant pr\u00e9parer le PCR :<\/p>\n

Mati\u00e8re premi\u00e8re du PCR<\/h1>\n

Ayant notre ARN isol\u00e9 dans l’\u00e9chantillon, nous faisons une deuxi\u00e8me pr\u00e9paration qui est sens\u00e9 se composer des “mati\u00e8res premi\u00e8res” du PCR. Ces mati\u00e8res sont :<\/p>\n

Transcriptase inverse :<\/strong> La transcriptase inverse ou r\u00e9trotranscriptase (en anglais reverse transcriptase ou encore RT) est une enzyme utilis\u00e9e par les r\u00e9trovirus et les r\u00e9trotransposons qui transcrivent l’information g\u00e9n\u00e9tique des virus ou r\u00e9trotransposons de l’ARN en ADN, qui peut s’int\u00e9grer dans le g\u00e9nome de l’h\u00f4te.<\/p>\n

Nucl\u00e9otides :<\/strong> ce sont des mol\u00e9cules organiques qui sont les \u00e9l\u00e9ments de base d’un acide nucl\u00e9ique tel que l’ADN ou l’ARN. Il est compos\u00e9 d’une base nucl\u00e9ique (ou base azot\u00e9e), d’un ose \u00e0 cinq atomes de carbone, dit pentose, dont l’association forme un nucl\u00e9oside, et enfin de un \u00e0 trois groupes phosphate.\u00a0 Imaginez le comme \u00e9tant l’alphabet ou les blocks qui servent \u00e0 composer un ADN.<\/p>\n

Amorces<\/strong> (deux amorces sont utilis\u00e9es forward\/reverse<\/strong>) : En biologie mol\u00e9culaire, l’amorce<\/b> est une courte s\u00e9quence d’ARN ou d’ADN, compl\u00e9mentaire du d\u00e9but d’une matrice, servant de point de d\u00e9part \u00e0 la synth\u00e8se du brin compl\u00e9mentaire de cette derni\u00e8re matrice par une ADN polym\u00e9rase.<\/p>\n

Sondes TaqMan :<\/strong> Les sondes TaqMan (TaqMan Probes) sont des sondes d’hydrolyse con\u00e7ues pour accro\u00eetre la sp\u00e9cificit\u00e9 des techniques de PCR quantitative. La m\u00e9thode a \u00e9t\u00e9 pour la premi\u00e8re fois d\u00e9crite en 1991 par des chercheurs de l’entreprise Cetus Corporation1, avant que le d\u00e9veloppement de cette technologie ne soit poursuivi par Roche Molecular Diagnostics pour des applications de diagnostics cliniques et Applied Bioscience pour des applications en recherche.\u00a0 cette sonde est essentielle pour le process de detection dont nous allons parler \u00e0 la fin de notre article.<\/p>\n

ADN Polym\u00e9rase :<\/strong> Une ADN polym\u00e9rase<\/b> est un complexe enzymatique intervenant dans la r\u00e9plication de l\u2019ADN au cours du cycle cellulaire, mais aussi dans des processus de r\u00e9paration et de recombinaison de l’ADN. Les ADN polym\u00e9rases utilisent des d\u00e9soxyribonucl\u00e9osides triphosphate comme base pour la synth\u00e8se d’un brin d’ADN, en utilisant un autre brin d’ADN comme matrice.<\/p>\n

Tous ces elements repr\u00e9sent\u00e9s dans l’image ci dessous repr\u00e9sentent le Master Mix qui sera utilis\u00e9 avec notre brin ARN pour initier le PCR :<\/p>\n

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Apr\u00e8s avoir mix\u00e9 (pulse mixating) ce mastermix avec l’arn extrait precedemment, ce nouvel echantillon est inser\u00e9 dans le test PCR. Il faut savoir qu’un appareil PCR contient 96 slots de test, pour permettre plusieurs tests en parrall\u00e8les. Chaque \u00e9chantillon utilise un slot.<\/p>\n

Conclusions premi\u00e8re partie :<\/h2>\n

Nous sommes \u00e0 pr\u00e9sent pret pour le test PCR, le prochain article d\u00e9crira les \u00e9tapes du test et les diff\u00e9rents cycles ainsi que le processus de detection (optique) \u00e0 travers la sonde TaqMan pour d\u00e9lib\u00e9rer sur le r\u00e9sultat du test.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Dans cette partie de la s\u00e9rie d’articles, nous allons traiter de la pr\u00e9paration de l’\u00e9chantillon, mais aussi du d\u00e9roulement du test et des diff\u00e9rentes phases pour comprendre comment se compose un appareil de test PCR.<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":7024,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_jetpack_memberships_contains_paid_content":false,"footnotes":"","jetpack_publicize_message":"Pr\u00e9paration pour le test PCR, suite de notre s\u00e9rie d'articles sur le d\u00e9pistage et le fonctionnement du test COVID. Merci \u00e0 ma s\u0153ur Kenza qui m'a gentillement pr\u00eat\u00e9 son cours de microbiologie !","jetpack_publicize_feature_enabled":true,"jetpack_social_post_already_shared":true,"jetpack_social_options":{"image_generator_settings":{"template":"highway","enabled":false},"version":2}},"categories":[93,5,6,97,9],"tags":[],"class_list":["post-6844","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-covid","category-featured","category-initiatives","category-science","category-technique"],"jetpack_publicize_connections":[],"jetpack_featured_media_url":"https:\/\/www.erroussafi.com\/wp-content\/uploads\/2020\/06\/testpcr.jpg","jetpack_sharing_enabled":true,"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/6844","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=6844"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/6844\/revisions"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media\/7024"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=6844"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=6844"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.erroussafi.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=6844"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}